[ -A | A+ ]
Imprimir Imprimir Recomienda a un amigo Recomienda a un amigo Bookmark and Share

Laboratorio de biología molecular

Laboratorio de Biología Molecular

Objetivo

Herramientas basadas en el estudio del ADN en la actualidad son tecnologías indispensables para el desarrollo de programas de control biológico. Enfoques moleculares se están utilizando frecuentemente para identificar de forma inequívoca plagas, organismos benéficos y biotipos, y para descifrar las relaciones entre las especies (es decir la sistemática). La identificación taxonómica exacta de las especies de plagas y enemigos naturales es reconocida como el primer paso esencial en el desarrollo de programas de control biológico de éxito. La incorrecta identificación puede provocar el fracaso del proyecto o significativamente detener el impulso hacia adelante. Por esta razón, el objetivo principal del laboratorio es la identificación y tipificación molecular de los organismos benéficos depositados en las colecciones de insectos entomófagos (CIE) y hongos entomopatógenos (CHE) del CNRCB, incluyendo los organismos de los programas de plagas reglamentadas.

Justificación

La taxonomía y sistemática han proporcionado el concepto de la existencia de especies crípticas, es decir, organismos que pueden diferir en su biología, ecología y comportamiento, pero no pueden ser identificados de forma confiable utilizando datos morfológicos. Sin embargo, la variación en el nivel molecular puede ser detectable y podría ser lo suficientemente grande como para justificar su reconocimiento como entidades biológicas separadas (las diferencias moleculares en el nivel de ADN son mayores entre las diferentes especies que dentro de la misma especie, debido a que la divergencia de secuencias es inferior entre individuos de una especie que entre las especies que están estrechamente relacionadas), incluso cuando las poblaciones son simpátricas. Además, la identificación taxonómica permite la comprensión de las asociaciones existentes entre las especies (ed., huésped o presa, plantas hospederas, preferencias de microhábitats, biotipos, distribución geográfica...). Esta información es esencial en el descubrimiento de enemigos naturales nuevos y viables, además de la selección de especies y biotipos apropiados para su utilización como agentes de control biológico. Así, la identificación del organismo es fundamental e importante en todas las etapas y fases, como: (1) Exploración; (2) Importación; (3) Cría masiva y liberación; y (4) Evaluación.

Sin embargo, la identificación a nivel de especie (información esencial) es una caracterización parcial de los organismos. Existen varias razones por las cuales es necesario caracterizar los organismos benéficos más allá del nivel especie y determinar la sub-especie o cepa según corresponda, por ejemplo, uno de los puntos más críticos en el desarrollo de un programa de control biológico es la posibilidad de rastrear el organismo después de la aplicación al ambiente para evaluar su eficiencia. Para alcanzar este objetivo, el primer paso es realizar una evaluación/estimación cualitativa acerca de la biodiversidad del microorganismo en el ecosistema y después de desarrollar marcadores moleculares específicos al organismo. En este sentido, el laboratorio está caracterizando los organismos benéficos acorde a una estrategia multigenética (MultiLocus Sequence Typing) y además está desarrollando otros marcadores moleculares (ej. microsatélites, inter-microsatélites) para lograr una amplia tipificación y de esta manera permitir en un futuro su rastreo.

Identificación molecular de hongos entomopatógenos

El LBM apoya en la identificación molecular de los aislados depositados en la CHE; de esta manera no sólo la determinación específica se realiza por métodos tradicionales sino que se involucra la secuenciación de diferentes regiones de ADN (zonas intergénicas, genes estructurales, funcionales y ribosomales). Para la identificación de hongos entomopatógenos, el LBM estandarizó e implementó una estrategia multigénica (MLST, por sus siglas en inglés) que conlleva la concatenación de tres o más regiones de ADN elegidas en base a su poder de discriminación y resolución. El procedimiento incluye, la extracción de ADN de cada muestra(s), la selección y amplificación por PCR de los distintos marcadores moleculares, servicio de secuenciación y el análisis bioinformático (edición e interpretación filogenética bajo diferentes métodos de reconstrucción filogenética: ej. Neighbour Joining, Máxima Verosimilitud, Máxima Parsimonia e Inferencia Bayesiana). 

Figura 1. Estrategia experimental para la identificación molecular de hongos entomopatógenos.

Estrategia experimental para la identificación molecular de hongos entomopatógenos.

De esta manera, la sistemática molecular y los análisis filogenéticos realizados para cada una de las muestras, proporcionan una aproximación confiable y certera. La Dirección General de Sanidad Vegetal (DGSV-SENASICA) a través del CNRCB, promueve el uso de hongos entomopatógenos en programas oficiales (Cuadro 1) para el combate de plagas agrícolas, por lo que es sumamente importante el establecimiento de una precisa identificación. A la fecha, el laboratorio ha identificado más de 70 aislados de la CHE entre los cuales se incluye a los géneros Metarhizium, Beauveria, Isaria, Hirsutella, Lecanicillium, Simplicillium, Aschersonia y Purpureocillium.

Cuadro 1. Aislados de la Colección de Hongos Entomopatógenos (CHE), identificados a nivel molecular que son utilizados en programas oficiales para el control biológico de plagas en México.

 

Aislados de la Colección de Hongos Entomopatógenos.

Identificación molecular de insectos entomófagos

La biodiversidad de insectos comprende la variedad de ecosistemas, especies y genes, por esta razón es una prioridad acelerar su descripción y conservación. El LBM contribuye estrechamente con la CIE en la determinación molecular de los organismos con el fin de complementar y enriquecer la identificación taxonómica realizada por la colección. Actualmente, el LBM realiza protocolos destructivos y no destructivos del tejido de ejemplares de insectos para la obtención de ADN, así como estrategias que permiten la identificación al nivel género o especie, por medio del código de barras de la vida, principalmente en el empleo del gen mitocondrial Citocromo Oxidasa I (COI). 

Los resultados en esta línea de investigación, se encuentran reflejados en el establecimiento y adecuación de protocolos específicos para obtener buena calidad del ADN de cada espécimen, así como protocolos que permitan obtener ADN de ejemplares únicos, con gran valor científico o de más de 20 años de colecta y aun así, conservar las características morfológicas en buenas condiciones. Adicionalmente, se ha logrado la estandarización de protocolos de PCR para las regiones COI con diversos primers y la estandarización de la región 28S de la subunidad mayor del ARN ribosomal. Hasta la fecha, se han identificado miembros de la familia Forficulidae (Doru spiculifarum), Chrysopidae (Ceraeochrysa cincta y Chrysoperla externa), Coccinellidae (Coleomegilla maculata, Cycloneda sanguinea, Hippodamia convergens...), Hymenoptera (Polistes exclamans, Tamarixia radiata…) y algunos miembros del orden Hemiptera, como son Orius insidiosus y Diaphorina citri.

Figura 2. Estrategia experimental para la identificación molecular de insectos entomófagos.

Estrategia experimental para la identificación molecular de insectos entomófagos.

El LBM, pretende consolidar una “metodología de identificación molecular” o “taxonomía por ADN” a partir de poco material de especies de diferentes insectos y en el futuro, lograr la determinación de especies crípticas o con ciclo de vida parcialmente/totalmente desconocido para contribuir con información nucleotídica a la base de datos electrónica que está siendo desarrollada por la CIE.

Tipificación molecular de los organismos benéficos

La evaluación de la diversidad genética es un enfoque importante en la investigación de la biología, ecología y evolución de una especie (ej. permite examinar la dinámica de población, patrones de migración); en el caso de los organismos benéficos, este conocimiento es fundamental. De hecho, el desarrollo de protocolos y la aplicación de estos organismos necesitan una profunda comprensión de la estructura genética de la población en los diferentes nichos ecológicos, así como la dinámica de la población. Además, el monitoreo/rastreo de las cepas de control biológico en el ambiente requiere de una caracterización genética hasta nivel genotípico con una alta resolución.

Para responder a las necesidades de una tipificación de alta resolución, el laboratorio está desarrollando principalmente dos tipos de marcadores moleculares: los microsatélites (Simple Sequence Repeat, SSR) e inter-microsatélites (ISSR). Los SSR son secuencias de ADN en las que un fragmento se repite de manera consecutiva, mientras que los ISSRs amplifican las regiones internas de los SSRs. Los SSR son actualmente uno de los marcadores más adecuados para la determinación genotípica y en la evaluación de la diversidad dentro de las especies. Por ejemplo, estos marcadores fueron desarrollados para la determinación del genotipo de cepas que contiene el complejo de especies M. anisopliae, teniendo éxito para la investigación de la diversidad molecular de diferentes colecciones.

A la fecha, el laboratorio está en el proceso de estandarización de la técnica de marcadores SSRs para la caracterización genotípica de aislados de hongos entomopatógenos utilizados en programas de plagas reglamentadas (ej., M. anisopliae: Huanglongbing (HLB) de los cítricos; M. acridum: Langosta y Chapulín) o con alto potencial (ej., B. bassiana: cultivo de aguacate). Adicionalmente, se está desarrollando la técnica de marcadores ISSRs para lograr una evaluación de la diversidad genética de las poblaciones de C. valida (HLB de los cítricos) presentes en el estado de Colima. Por ejemplo, esta técnica permitió al laboratorio un análisis de los aislados de I. javanica utilizado en el programa del HLB (Fig. 3).

Figura 3. Caracterización genética de seis aislados de Isaria con los marcadores inter-simple sequence repeat-polymerase (ISSR). A: Ejemplo de un electroferograma obtenido con el primer (GTG)5. B: Coeficiente de similitud de Dice de 4 marcadores ISSR expresado en porcentaje para cada aislado.

Figura 3. CNRCB Marcadores ISSR

Actividades adicionales

El laboratorio colabora de igual manera en las distintas áreas del CNRCB en varios proyectos de investigación:

  1. Evaluación de la estabilidad genética de hongos entomopatógenos antes y después de ser sometidos a diferentes métodos de conservación. La determinación se hace con la técnica de polimorfismos en la longitud de fragmentos amplificados (AFLP, por sus siglas en inglés); la finalidad de este proyecto es apoyar a la CHE en la selección de los mejores métodos de conservación.
  2. Desarrollo de la técnica de detección de haplotipos en insectos entomófagos con la secuencuación del gen COI; apoyo para el control de calidad en la reproducción masiva de insectos entomófagos (ej. T. radiata y C. valida).

Formación de recursos humanos

El laboratorio recibe estudiantes de licenciatura, ingeniería y maestría para la realización de estancias profesionales y desarrollo de tésis.

Visitas científicas y guiadas

Se realizan visitas a través de las instalaciones del LBM para el público en general, estudiantes e investigadores con el propósito de que conozcan las instalaciones y el trabajo que se realiza en el laboratorio.

Difusión

El LBM elabora documentos de divulgación y material científico para presentar los avances de los distintos proyectos que desarrolla en la comunidad científica experta en materia de control biológico.

Publicaciones

Gallou A, Serna-Domínguez MG, Berlanga-Padilla AM, Ayala-Zermeño MA, Mellin-Rosas MA, Montesinos-Matías R, Arredondo-Bernal HC (2016) Species clarification of Isaria isolates used as biocontrol agents against Diaphorina citri (Hemiptera: Liviidae) in México. Fungal Biology 120: 414-423.

Hernández-Hernández FS, Mendoza-Villarreal R, Robledo-Torres V, Gallou A, Cárdenas-Flores A, Valdéz-Aguilar LA (2015) Assessment and morphological characterization from isolates of native mycorrhizal associated with tomatillo. Revista mexicana de Ciencias Agrícolas, Pub. Esp. Núm. 12: 2277-2289.

Ayala-Zermeño MA, Gallou A, Berlanga-Padilla AM, Serna-Domínguez MG, Arredondo-Bernal HC, Montesinos-Matías R (2015) Characterization of entomopathogenic fungi used in the biological control programme of Diaphorina citri in México. Biocontrol Science and Technology 25: 1192-1207.

Poghosyan A, Hernández-González J, Gallou A, Andrade-Michel G, Palacios-Cardiel C, Lebsky V (2015) Fisrt report of "Candidatus Phytoplasma asteris" in Kumquat (Citrus japonica) with HLB-like Symptoms in La Paz, Baja California Sur, México. Plant Disease 99: 552.

Gallou A, Suaste-Dzul AP, Serna-Domínguez MG, Andrade-Michel GY (2015) Manual de prácticas de laboratorio de biología molecular. Pp. 94. ISBN: 978-968-5384-09-4.

Laboratorio de Biología Molecular

Preparación para un corrida con el equipo: Fragment Analyzer.

Instalaciones Laboratorio de Biología Molecular

Última modificación: 23 de Junio de 2016 10:15:04
Por: Sanidad Vegetal


Estamos próximos a migrar al portal único de gobierno ¿Ya lo conoces? Comienza a utilizar gob.mx